灵芪胶囊对直结肠癌 lovo 细胞凋亡相关基因表达的影响

来源： 　作者：　 时间：2015-11-10

灵芪胶囊源于传统医药方剂，经现代化的加工制成，方中灵芝等名贵中草药对于肿瘤的治疗具有一定的疗效。通过前期研究，笔者发现，灵芪胶囊对于消化道肿瘤具有一定的抑制作用。本课题选取直结肠癌细胞lovo细胞，进一步探讨灵芪胶囊对直结肠癌lovo细胞肿瘤凋亡相关基因表达的作用及机制。
1材料与方法
1．1细胞株人源性直结肠癌lovo细胞:由黑龙江省肿瘤医院提供。
1．2药物与试剂灵芪胶囊，药物组成:黄芪、灵芝、莪术、茯苓、人参、贯众、山药、枸杞子、重楼、山慈菇等。该胶囊由本教研室自行制备，每颗胶囊约含生药量为1．65g，于4℃冰箱存放备用，实验时配制成混悬液;5-氟尿嘧啶注射液(天津金耀氨基酸有限公司提供，批号:20120424，国药准字:H2020959);BSA(哈尔滨赛拓科技有限公司);抗体Caspase3(H-170):sc-13-87(Santa生物公司);二抗ＲbLgG(H+1)/FLTO(中杉，哈尔滨赛拓科技有限公司);β-actin(上海翔升生物科技有限公司专业提供);显色液和蛋白Marker(碧云天生物技术研究所提供);转膜液SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)自行配制;TBS缓冲液;TBST缓冲液;BSA封闭液;1．5mol·L－1TrisHCL(pH8．8);1．0mol·L－1TrisHCL(pH6.8);1．0mol·L－1TrisHCL(pH7．5);质量分数30%丙烯酰胺;质量分数20%Tween20;质量分数10%SDS;质量分数10%过硫酸铵AP;G250考马斯亮蓝溶液(蛋白定量专用);单去污剂裂解液(PMSF);电泳液缓冲液;转膜缓冲液。
1．3实验仪器蛋白质印迹法所用器材由黑龙江省肿瘤医院提供;电泳仪(北京赛百奥科技有限公司);DYY-12及凝胶成像仪(UVPUSA);紫外可见光分光光度计(日本岛津公司);PVDF膜和滤纸(选欧尔公司);离心管(eppendorf公司)。
1．4实验方法
1．4．1实验分组将Wistar大鼠随机分为5组，每组10只，灵芪胶囊高剂量组予以灵芪胶囊35．64g·(kg·d)－1灌胃，灵芪胶囊中剂量组予以灵芪胶囊17．82g·(kg·d)－1灌胃，灵芪胶囊低剂量组予以灵芪胶囊8．91g·(kg·d)－1灌胃，阳性对照组予以5-氟尿嘧啶注射液0.027g·(kg·d)－1灌胃，空白对照组予以等体积生理盐水灌胃，给药7d后取血，分离血清，去除杂质，滤过灭菌，－4℃放置备用。将不同组别的对数生长期的lovo细胞培养至细胞贴壁后，分别放入相应的含药血清，48h后收集细胞。
1．4．2提取蛋白①收集细胞:将不同组别的细胞用胰蛋白酶进行消化，用质量分数0．9%氯化钠注射液洗3遍，PBS4℃(10min)，转到EP管中，4000r·min－1离心5min(离心半径8cm)，倒弃上清液，重复洗涤3遍。②细胞裂解:每管细胞加入裂解液200μL，与细胞充分混匀。温度4℃，每间隔15min涡旋1次，使得细胞得以充分裂解，将裂解后的细胞离心(12000r·min－1，4℃，离心半径8cm)提取上清液备用。
1．4．3检测蛋白含量应用考马斯亮蓝法检测蛋白含量，计算蛋白的上样量。
1．4．4冻存变形的蛋白样本放置于6×loddingbuffer中，99℃水浴中进行涡旋，约5min。冷却后，冻存，长期存放于－80℃冰箱。
1．4．5蛋白质印迹法流程玻璃板洗净、晾干备用，放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。配制质量分数10%分离胶，需要以下材料:质量分数10%分离胶7mL，去离子水2．8mL，质量分数30%丙烯酰胺ACＲ2．31mL，Tris(pH8．8)1．75mL，质量分数10%SDS70μL，质量分数10%过硫酸铵AP70μL。加入TEMED3μL后立即摇匀即可灌胶。将滤纸及PVD膜泡在转膜液中。

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